Учебный центр «Крисмас+»

ЭНЗИМАТИЧЕСКОЕ ПОТЕМНЕНИЕ ТКАНЕЙ ПЛОДОВ РАСТЕНИЙ.

Автор: Грега Михаил, 10 кл.

ГБОУ СОШ №1, г. Санкт-Петербург

Руководитель: Ласточкин В. В.

Потемнение растительных тканей – процесс изменения их окраски, происходящий в результате химической реакции с участием или без участия ферментов. Многие фрукты и овощи, используемые в пищу, могут подвергаться потемнению при длительном хранении, созревании, изменении температуры, а также при разрезании и других повреждающих воздействиях. Потемнение, связанное с активностью ферментов, и более характерное для низкотемпературного воздействия, получило название энзиматического. Последнее катализируется ферментами полифенолоксидазой (ПФО) и пероксидазой (ПОД), происходит во многих фруктах и овощах и приводит к потере их качества. В связи с этим, детальное изучение факторов, влияющих на активность полифенолоксидаз, имеет большое практическое значение в пищевой промышленности для контроля и регуляции их энзиматической активности в пищевых продуктах растительного происхождения.

Цель работы: изучение энзиматического потемнения тканей плодов растений из разных систематических групп и выявление его причин.

Задачи работы:

1. Выделение ферментативного экстракта из мякоти плодов банана, груши и яблока, а также из кожуры банана при разных сроках хранения.

2. Определение активности полифенолоксидазы и пероксидазы в выделенных экстрактах.

3. Изучение влияния пониженных и повышенных температур на активность ферментов экстракта.

4. Изучение изоферментного состава пероксидаз и полифенолоксидаз у нормальных и потемневших плодов.

Из литературы известны принципы функционирования ферментов, участвующих в процессах браунинга, а также возможности их биосинтеза в тканях растений при созревании и повреждении плодов, однако отсутствует системный анализ этого процесса у растений.

Объекты исследования. Объектами исследования являлись ягоды банана (Musa sp.) яблоки яблони (Malus sp.) и груши (Pyrus sp.), а также соплодия ананаса (Ananas sp.), которые приобретали в магазине в зрелом состоянии, не имеющими признаков потемнения. Для изучения влияния воздействия низких и повышенных температур плоды выдерживались в холодильнике (+4^оС) в течение всего срока эксперимента или предварительно нагревались в термостате (до +55^оС) в течение 3 часов перед началом эксперимента.

Методы исследования. Для экстракции ферментов растительный материал гомогенизировали и экстрагировали фосфатным буфером, затем центрифугировали и супернатант использовали для определения активности ферментов, которую определяли на спектрофотометре при помощи качественных реакций.

Пероксидазы и полифенолоксидазы фракционировали методом электрофореза на пластинах полиакриламидного геля в кислой буферной системе (Davis, 1964).

Влияние низких температур на потемнение плодов. Хранение плодов банана и соплодий ананаса в холодильнике стимулирует процессы потемнения (рис. 1), что хорошо согласуется с литературными данными (Lyons, 1973).

начало эксперимента 48 часов хранения 120 часов хранения

Рис. 1. Последовательность потемнения плодов банана (Musa sp.), хранящихся при 25ºС (справа) и при 4ºС (слева).

Напротив, плоды яблони и груши темнели только при наличии повреждения, причём очень быстро и далее не изменяли интенсивности своей окраски. Их потеменение не зависило от температуры окружающей среды.

Влияние температурной обработки на активность полифенолоксидазы плодов. Активность полифенолоксидазы мякоти и кожуры плодов банана, а также соплодий ананаса возрастала при увеличении сроков экспозиции вне зависимости от условий хранения (рис. 2). При охлаждении плода активация фермента была максимальной, тогда как предварительный прогрев не только практически препятствовал активации ПФО, но и снижал активность фермента при последующем хранении плодов при 4ºС (рис. 2). Данные об активации полифенолоксидазы плодов бананов по мере их созревания в литературе имеются (Weaver, 1974). Автор связывал активацию ПФО с накоплением белка фермента. Таким образом, снижение активации фермента после предварительного прогрева, по-видимому, связана с разрушением белка ПФО, что могло быть вызвано тепловой денатурацией белка (Vierling, 1991).

Рис. 2. Влияние температурной обработки на активность полифенолоксидазы мякоти плодов банана.

Следует также отметить, что активность ПФО у растений семейства Розоцветные во время хранения как при 25ºС, так и при низких температурах практически не менялась, несколько возрастая только к длительным срокам экспозиции.

Влияние температурной обработки на активность пероксидазы плодов. Активность пероксидазы в тканях банана и ананаса не зависела ни от каких факторов (рис. 3), сохраняясь на одном и том же, близком к контрольному, уровне, как при охлаждении плода, так и при его прогреве.

Рис. 3. Влияние температурной обработки на активность пероксидазы кожуры банана.

Совсем по иному происходили изменения в активности пероксидаз растений семейства Розоцветные. Так, находясь на достаточно низком уровне, ПОД по мере потемнения плодов активировалась, превышая начальный уровень в 10-12 раз.

Полученные результаты, показывающие активацию различных ферментов, способствующих потемнению плодов, заставляют задуматься о причинах подобной активации. Имеются сведения о биосинтезе новых изоформ полифенолоксидаз при созревании в тканях растений (Gooding et al., 2001). С целью проверки возможности биосинтеза новых изоформ ферментов был проведён электрофорез белков.

Изоферментный состав полифенолоксидаз и пероксидаз плодов растений. Было показано, что потемнение плодов банана стимулирует появление новых изоформ ПФО как в мякоти, так и в кожуре. По-видимому, нами были обнаружены те же изоформы ПФО, гены которых были клонированы ранее: ВРО1, ВРО11, ВРО12, ВРО34 и ВРО 35. (Gooding et al., 2001). Потемнение плодов яблока и груши не вызывает появления новых изоформ ПФО, скорее наоборот, приводит к снижению активности уже имеющихся.

Совершенно противоположные результаты были получены при изучении изоформ пероксидаз. Так, в мякоти банана, наблюдалось снижение активности всех имеющихся изоформ. В кожуре можно было заметить некоторую их активацию, однако появления новых изозимов не наблюдалось. Изопероксидазы возникали только у яблони и груши в процессе потемнения их плодов.

Таким образом, у растений, обладающих способностью к потемнению при понижении температуры, наблюдается увеличение активности ПФО при созревании, связанное с образованием новых изоферментов, а также относительно невысокая, мало изменяющаяся в процессе онтогенеза активность пероксидаз. Напротив, растения, плоды которых темнеют вне зависимости от температурного фактора, образуют новые изопероксидазы, тогда как активность ПФО у них сохраняется на низком и относительно постоянном уровне.

Выводы.

1. Потемнение плодов банана и соплодий ананаса стимулируется при их охлаждении, практически не изменяется при тепловой обработке и связано с работой полифенолоксидаз.

2. Пероксидазы растительных клеток способствуют потемнению тканей растений семейства Розоцветных, активируясь в их тканях при хранении плодов.

3. Потемнение тканей банана сопровождается появлением новых изоформ полифенолоксидаз, а потемнение плодов яблони и груши – появлением новых изопероксидаз.

4. В кожуре банана имеется особая изоформа, биосинтез которой начинается только во время потемнения плода.

5. Растения имеют две различные стратегии потемнения: растения, способные к потемнению при понижении температуры, обладающие возможностью к увеличению активности ПФО при созревании, и растения, плоды которых темнеют вне зависимости от температурного фактора, образующие новые изопероксидазы.

Источники информации в литературе.

1. Андреева В.А. Фермент пероксидаза. - М., Наука, -1988. - 340 с.

2. Gooding P.S., Bird C., Robinson S.P. 2001. Polyphenol oxidase activity and gene expression in the fruit of Goldfinger bananas (AAAB, FHIA-01). Infomusa. 10: 17-22.

3. Griffiths L.A. 1959. Detection and identification of the polyphenoloxidase substrate of the banana. Nature. 184: 58-59.

4. Lyons J.M. 1973. Chilling injury in plants. Ann. Rev. Plant Physiol. 24: 445-466.

5. Palmer J.K. 1963. Banana polyphenoloxidase. Preparetion and properties. Plant Physiol. 38: 508-513.

См. также

Путеводитель по выбору оборудования для учебно-исследовательских работ

Этот материал опубликован в Сборнике тезисов участников IX Международного конкурса «Инструментальные исследования окружающей среды»