Учебный центр «Крисмас+»

Изменение содержания хитина и белков при развитии плодовых тел навозниковых грибов.
Автор: Матвеев Илья, 9 кл.,ГБОУ СОШ №1, г. Санкт-Петербург, руководитель: Ласточкин В.В.

Грибы (по латыни – Fungi или Mycota) – царство живой природы, объединяющее эукариотические организмы, сочетающие в себе некоторые признаки как растений, так и животных. Грибы изучает наука микология, которая считалась разделом ботаники, поскольку ранее грибы ранее относили к царству растений.
Понятие о грибах как об отдельном царстве сформировалось в науке к 1970-м годам, хотя выделить это царство предлагал ещё Э. Фрис в 1831 году, а Карл Линней высказывал сомнения, размещая грибы в царстве растений в своей «Системе природы». Во второй половине XX века окончательно сформировалось и представление о полифилетизме грибов. К концу XX века были накоплены данные по генетике, цитологии и биохимии, позволившие разделить эту группу организмов на несколько не родственных между собой ветвей и распределить их между различными царствами, оставив в царстве «настоящих», или собственно грибов, только одну из них.
Таким образом, научный термин «грибы» в начале XXI века стал неоднозначным. В узком смысле, относящемся к биологической систематике, это – название таксона, одного из царств живой природы. В старом же, более широком смысле, термин потерял значение таксона и обозначает эколого-трофическую группу, объединяющую гетеротрофных эукариот с осмотрофным типом питания. Такие организмы по исторической традиции продолжают изучаться микологией.
Грибы играют важную роль в жизни человека не только как пищевые продукты, но и как организмы, принимающие участие в биотехнологических процессах. Тем не менее, микологами и генетиками обычно изучаются процессы, связанные с изменением наследственного материала грибов и с особенностями их систематики. Процессы же жизнедеятельности грибов, особенно биохимические процессы, изучены слабо. Как не странно, в меньшей мере проводятся исследования физиолого-биохимических процессов грибов-макромицетов. Не исключение и интереснейшие грибы-навозники.
Целью работы стало изучение изменения содержания хитина и белков при развитии плодовых тел навозниковых грибов.
Нами были поставлены следующие задачи:
1. Изучить этапы развития навозниковых грибов.
2. Определить содержание хитина в клетках грибов на разных стадиях развития.
3. Определить содержание белка в плодовых телах на разных этапах созревания.
4. Используя ингибиторы белков (цистатин и аллозамидин) изучить принцип автолиза.
Объекты исследования. Объектами исследования являлись плодовые тела навозника белого (Coprinus comatus) и навозника серого (Coprinopsis atramentaria), которые собирали для каждой серии эксперимента на одном участке с интервалами в 24 часа от начала их появления до полного автолиза. Методы исследования. Обработку опытного участка ингибиторами проводили следующим образом. За месяц до срока прошлогоднего появления плодовых тел навозника делянка подвергалась поливу раствора 0,2 М цистатина (Sigma) выделенного из каштана (специфичен к микопротеазам) и 0,2 М аллозамидина (Sigma). Полив осуществлялся каждые три дня вплоть до появления плодовых тел гриба, а также ещё в течение одной недели после их формирования.
Для определения содержания хитина брали 1 г испытуемого материала, и гидролизовали 5 мл 6 Н НС1 в закрытых сосудах при 80°С 16 ч. Полученный гидролизат фильтровали, выдерживали при 75°С, а затем сухой остаток растворяли в дистиллированной воде.
К полученному раствору добавляли реактив следующего состава: парадиметиламинобензальдегид – 100 мл, 96%-ный этанол – 9,5 мл, НС1 концентрированная – 2 мл. В результате получали розовый раствор, интенсивность светопоглощения которого определяли на спектрофотометре при 530 нм и сравнивали со стандартной кривой, построенной в пределах от 8 до 28 мкг гексозамина.
Для определения содержания белков грибную ткань гомогенизировали и экстрагировали 0,02 М K, Na-фосфатным буфером 30 мин (рН 6,5, соотношение 1:10). После центрифугирования (15 мин, 5500 g) супернатант собирали и использовали для определения белка методом Брэдфорд (Bradford, 1976). Оптическую плотность измеряли спектрофотометрически при 595 нм. Калибровочная кривая была построена для овальбумина.
Результаты исследования. На первом этапе исследования были проведены наблюдения за автолизом плодовых тел навозников. Было установлено, что полный автолиз происходит у навозников за 120 часов (рис. 1).

Результаты, полученные после 120 ч наблюдения за обоими плодовыми телами не различались, и «плодовые тела» представляли собой полностью автолизированные тёмные жижи.
При изучении содержания хитина у обоих навозников были получены следующие результаты. Содержание хитина неуклонно падало по мере созревания плодового тела (рис. 2) у обоих грибов. Таким образом, автолиз сопровождается разрушением хитиновых оболочек клеток.

Несколько иные результаты были получены при анализе содержания белка в плодовых телах навозников. Так, наблюдалось увеличение содержания белка, связанное, по-видимому, с активацией ферментов разрушающих хитин (например, хитиназ). Однако, по мере автолиза, к окончанию этого процесса наблюдалось снижение содержания белка.
 
Последующее сокращение содержания белка, возможно, связано с нарушением структуры клеток при автолизе, что позволяет содержимому клеток вытекать вместе с имеющимися белками. Гораздо более интересными были результаты, полученные при наблюдении за плодовыми телами Coprinus comatus и Coprinopsis atramentaria, произрастающими на обрабатываемых цистатином и аллозомидином делянках. Их внешний вид не изменялся по мере роста на делянке. Через некоторое время на делянке обнаруживалось большое количество неавтолизированных плодовых те, признаки разрушения которых, начинали появляться только на 5 сутки наблюдения (рис. 3).

Из диаграммы видно, что отсутствие автолиза определяется сохранением содержания хитина на первоначальном уровне. У обоих грибов содержание хитина не изменяется, что и позволяет сохранять клетки в целости. Интересным остаётся тот факт, возможно ли повлиять на автолиз плодовых тел, используя ингибиторы биосинтеза белка и транкрипции, однако это предмет дальнейших исследований. Содержания белка в обрабатываемых цистатином плодовых телах навозника белого (Coprinus comatus) и навозника серого (Coprinopsis atramentaria) постоянно росло (рис. 13), что легко объясняется ингибированием протеаз цистатином, что и приводило к накоплению иных белков.
Выводы.
1. Автолиз навозниковых грибов полностью протекает за 5 суток.
2. Во время автолиза наблюдается разрушение хитновых оболочек клеток.
3. Для осуществления процесса автолиза в мицелии гриба накапливается белок, содержание которого начинает снижаться при сильном автолизе плодовых тел.
4. Аллозомидин, ингибируя хитиназы, способствует укреплению клеточных оболочек, тем самым препятствует автолизу плодовых тел.
5. Цистатин, как ингибитор, препятствует работе гидролитических ферментов, которые содержатся в мицелии гриба, что нарушает развитие автолиза.
Источники информации в литературе.
1. Гарибова Л. В., Лекомцева С. Н. Основы микологии: Морфология и систематика грибов и грибоподобных организмов. Учебное пособие. — М.: Т-во научных изданий КМК, 2005. — 220 с.
2. Семёнов А.И. О грибах и грибниках: Справочник по сбору грибов в Крыму. — Симферополь: «Таврия», 1990. — С. 74 — 76.
3. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. -1976. -V. 72. -P.248.
4. Chavan J.K , Hejgaard J // J. Sci. Food Agric 1981. v 32 №6.
5. Ojima A., Shiota H., Higashi K., Kamada H., Shimma Y., Wada M., Satoh S. // Plant Mol. Biol. 1997. V. 34. №1.
См. также

Путеводитель по выбору оборудования для учебно-исследовательских работ

Этот материал опубликован в Сборнике тезисов участников X Международного конкурса «Инструментальные исследования окружающей среды»

6. Pernas M., Lopez Solanilla E., Sanchez Monge R., Salcedo G., RodriguezPalenzuela P. // Mol. Plant Microbe, 1999