Учебный центр «Крисмас+»

Генерация активных формкислорода в условиях аноксии и постаноксической аэрации.
Автор: Трофимова Валерия, 9 кл.,ГБОУ СОШ №1, г. Санкт-Петербург.Руководитель: Ласточкин В.В.

Живые организмы постоянно испытывают на себе влияние различных факторов окружающей среды. Растения, в силу своего прикрепленного образа жизни, особенно подвержены этим воздействиям. Одним из широко распространенных неблагоприятных факторов является кислородная недостаточность, которая наблюдается при затоплении растений, образовании ледяной корки на поверхности почвы при выращивании озимых злаков, создании асфальтовых покрытий в городах и т.д. С гипоксическим или аноксическим воздействием тесно связано влияние еще одного неблагоприятного фактора – окислительного стресса, который возникает сразу после действия кислородной недостаточности, когда растения вновь оказываются в условиях нормальной аэрации. В природе окислительный стресс – прямое следствие гипоксии и аноксии, поэтому устойчивые к кислородной недостаточности растения, по-видимому, должны обладать устойчивостью и к этому воздействию.
Постоянное или временное переувлажнение характерно для многих регионов Земли, и в том числе для Северо-Запада России. Подобные условия способствуют возникновению кислородной недостаточности, при этом ограничивается жизнедеятельность представителей дикой флоры и создаются трудности для возделывания сельскохозяйственных культур. Поэтому изучение путей адаптации растений к кислородной недостаточности и последующей реаэрации представляет большой интерес и имеет значительную практическую ценность.
Целью работы стало изучение генерации активных форм кислорода (АФК) (супероксидного анион-радикала и пероксида водорода) в тканях растений, контрастных по устойчивости к гипоксии.
В задачи работы входило:
1. Определить продукцию супероксидного анион-радикала в условиях аноксии и при краткосрочной реаэрации;
2. Изучить особенности генерации пероксида водорода в указанных выше условиях;
3. Сопоставить накопление АФК у растений пшеницы и риса в условиях аноксии и при постаноксической аэрации.
Объекты исследования. Объектами исследования являлись 7-дневные проростки пшеницы (Triticum aestivum) и 10-дневные проростки риса (Oryza sativa). Пшеницу использовали в качестве неустойчивого, а рис – устойчивого к гипоксии растения.
Методы исследования. Часть растений использовали для анализа в качестве исходного материала, оставшуюся часть разделяли на опытные и контрольные варианты. Для создания анаэробных условий растения опытных вариантов помещали в камеры объёмом 1,5 л, через которые 40 минут пропускали газообразный азот, затем камеры герметично закрывали и помещали в темноту для предотвращения образования кислорода на свету. Экспозиция в атмосфере азота составляла 12 и 24 ч. Контрольные растения находились в темноте в условиях аэрации. Для создания условий реаэрации опытные растения вынимали из камер и оставляли на воздухе в темноте на 5, 10, 15, 30, 60 минут, 12 и 24 ч после каждого из сроков в бескислородной среде. После выдерживания в описанных выше условиях растения использовали для определения содержания АФК.
Количество супероксида определяли спектрофотометрическим методом с использованием акцептора электронов адреналина, который в присутствии супероксида превращается в адренохром. Образование последнего регистрировали на спектрофотометре UNICO при длине волны 480 нм. Количество H2O2 определяли спектрофотометрическим методом при помощи ксиленового оранжевого (Sigma). Для этого заранее готовили два реактива. Первый из них состоял из 25 мМ FeSO4 и 25 мM (NH4)2SO4, которые растворяли в 2,5 М серной кислоте. 1 мл этого раствора добавляли к 100 мл другого, содержащего 0,1 М сорбит и 125 мкМ ксиленового оранжевого (Gray et al., 1999). Для определения содержания пероксида водорода отрезки растительной ткани длиной 30 мм помещали в него на 30 минут в темноте. Об уровне продукции судили на основании изменения оптической плотности раствора при 560 нм на спектрофотометре UNICO. Для определения абсолютных значений содержания Н2О2 была построена калибровочная кривая по стандартным растворам пероксида водорода.
Продукция супероксидного анион-радикала при аноксии и в условиях реаэрации. Исходный уровень супероксид анион-радикала, как в побегах, так и в корнях риса был выше, чем у пшеницы (рис. 1).

Под влиянием аноксии и у риса и у пшеницы в побегах и корнях наблюдалось некоторое снижение содержания супероксидного анион-радикала при обоих сроках экспозиции, связанное, по-видимому, с отсутствием кислорода в среде пребывания растений (рис. 1).
При реаэрации у обоих растений продукция супероксидного анион-радикала постепенно нарастала (рис. 1), что было более заметно у пшеницы. Наибольшей величины, превышающей контрольную, у пшеницы она достигала к 15-30 минутам пребывания растений на воздухе, после чего снижалась. У риса же изменения в содержании супероксидного анион-радикала во время реоксигенации были выражены в меньшей мере, происходил лишь медленный подъём его продукции до контрольного уровня.
Таким образом, образование супероксидного анион-радикала у риса, в отличие от пшеницы, менялось во время экспозиции в меньшей мере, что, вероятно, указывает на его большую способность к регуляции поставки и использования данной АФК.
Генерация пероксида водорода в условиях аноксии и постаноксической реаэрации. Поскольку в процессе одноэлектронного восстановления супероксидного анион-радикала супероксиддисмутазой он превращается в пероксид водорода, мы рассмотрели также влияние аноксии и постаноксической аэрации на продукцию пероксида водорода в побегах и корнях проростков пшеницы и риса. Оказалось, что исходный уровень продукции пероксида у риса, также как и супероксидного анион-радикала, был выше, чем у пшеницы (рис. 2).

У проростков пшеницы аноксия не приводила к существенному изменению в содержании пероксида водорода. У риса, в отличие от пшеницы, аноксическое воздействие значительно снижало уровень продукции, причём тем больше, чем длительнее была экспозиция в атмосфере азота (рис. 2).
Во время реоксигенации у обоих растений уровень продукции пероксида водорода повышался. У пшеницы, как в побегах, так и в корнях после 12 и 24 ч аноксии происходило резкое (5-кратное) увеличение продукции через 15 минут пребывания на воздухе, после чего количество пероксида снижалось до контрольного уровня (рис. 2). После 72 часов аноксии уровень пероксида сохранялся высоким не только после 15, но и после 30 мин реаэрации, и не достигал исходной величины даже через 1 ч (рис. 2).
Продукция же пероксида в побегах и корнях риса при аэрации незначительно превышала контрольные значения и лишь в корнях несколько вырастала через 15 мин после переноса растений на воздух (рис. 2). Сопоставляя результаты определения содержания супероксидного анион-радикала и пероксида водорода, можно заключить, что изменения в уровне обеих АФК у растений, различающихся по устойчивости, были сходными. Однако, несмотря на более высокое содержание и супероксидного анион-радикала и H2O2 у риса, по сравнению с пшеницей, значительного накопления этих АФК при реаэрации у него не происходило. Полученные данные могут свидетельствовать о более эффективной работе у риса как систем продукции АФК, так и антиоксидантной системы, в частности каталазы и пероксидаз, участвующих в распаде пероксида водорода.
Выводы:
1. Уровень образования супероксидного анион-радикала и генерации пероксида водорода у устойчивого к гипоксии растения выше, чем у неустойчивого.
2. В бескислородных условиях количество О2•- в тканях снижается.
3. Снижение генерации пероксида водорода происходило только в тканях риса.
4. В условиях реаэрации происходит повышение продукции супероксида до исходного уровня у риса и сверх него у пшеницы.
5. Реаэрация стимулирует накопление пероксида водорода у обоих растений, особо заметное у риса, которое впоследствии нивелируется, в то время как у пшеницы генерация пероксида сохраняется на относительно высоком уровне.
Источники информации в литературе:
1. Мерзляк М.Н. активированный кислород и жизнедеятельность растений. // Соросовский образ. журнал. –1999. №9. –С.20-26.
2. Чиркова Т.В. Пути адаптации растений к гипоксии и аноксии. - Л.: изд-во Ленингр. ун-та. -1988. -244 с.
3. Чиркова Т.В., Блохина О.Б. Влияние аноксии на уровень эндогенного перекисного окисления липидов в корнях растений, различающихся по устойчивости к недостатку кислорода. // Вестн. ЛГУ. Биология. –1991. –Вып.4. –С.85-90.
4. Blockhina O.B., Fagerstedt K.V., Chirkova T.V. Anoxic stress leads to hydrogen peroxide formation in plant cells. // J. Exp. Bot. -2001. -V. 52, N 359. -P. 1179-1190.
5. Crawford R.M.M., Walton J.C., Wollenweber-Ratser B. Similarities between post-ischaemic injury to animal tissues and post-anoxic injury in plants. // Proceedings of the Royal Society of Edinburgh. – Edinburgh, 1994. –V.102b. –P.325-332.
См. также

Путеводитель по выбору оборудования для учебно-исследовательских работ

Этот материал опубликован в Сборнике тезисов участников X Международного конкурса «Инструментальные исследования окружающей среды»